4.Бактериофаги. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. Умеренные и вирулентные бактериофаги. Лизогения.

Бактериофаги— вирусы бактерий, обладающие способностью специфически проникать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вызывать их растворение (лизис).

Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, авто­номно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающим­ся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30—40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

Умеренные фагилизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков.

Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т. е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней перено­сит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.

5.Бактериофаги. Получение. Титрование. Использование.Практическое применение фагов. Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т. е. определении фаговара (фаготипа). Для этого применяют методфаготипирования, основанный на строгой специфичности действия фагов: на чашку с плотной питательной средой, засеянной «газоном» чистой культурой возбудителя, наносят капли различных диагностических типоспецифических фагов. Фаговар бактерии определяется тем типом фага, который вызвал ее лизис (образование стерильного пятна, «бляшки», или «негативной колонии», фага). Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). Выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды(например, в воде) можно судить о присутствии в них соответствующих патогенных бактерий. Подобные исследования проводят при эпидемиологическом анализе вспышек инфекционных болезней.

Фаги применяют также для лечения и профилактики ряда бактериальных инфекций. Производят брюшнотифозный, сальмонеллезный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый, стрептококковый фаги и комбинированные препараты (колипротейный, пиобактериофаги и др.). Бактериофаги назначают по показаниям перорально, парентерально или местно в виде жидких, таблетированных форм, свечей или аэрозолей.

Бактериофаги широко применяют в генной инженерии и биотехнологиив качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК.Титрование бактериофага - определение активности бактериофага по способности различных разведений его взвеси лизировать бактериальные культуры в жидких питательных средах или образовывать негативные колонии в бактериальном газоне на плотных питательных средах.Существуют 2 метода титрования бактериофагов: метод по Аппельману (в жидкой питательной среде) и по Грациа (на плотной среде).

По Аппельману, титром в жидкой питательной среде называется то максимальное разведение, которое даёт полный лизис бактерий.

По Грациа, титр – количество активных фаговых частиц в пересчёте на 1 мл неразведённого фага. Количество активных фаговых частиц в 1 мл = количество зон лизиса * величина обратного разведения. Метод по Грациа более точный. ( см. тетрадь)

6.Внехромосомные факторы наследственности у бактерий. К внехромомсомным факторам наследственности относят плазмиды и эписомы, которые располагаются в цитоплазме клетки. Плазмиды не способны встраиваться в нуклеотид бактерии, они имеют собственную ДНК, которая может самостоятельно реплицироваться. В противоположность плазмидам, эписомы встраиваются в нуклеотид бактерии и функционируют вместе с ним.

Плазмиды, не зависимо от нуклеоида, обеспечивают способность к коньюгации, устойчивость к антибиотикам и другим веществам. Установлено, что наличие плазмид в клетке не обязательно, но в тоже время их может быть несколько. Плазмиды подразделяют на коньюгативные (трансмисивные) и неконьюгативные (на трансмиссивные). Первые – придают клетке свойства генетического донора, детерминируют перенос генетического материала от клетки донора к клетке реципиенту, вторые – не придают клетке свойств генетического донора, не могут передаваться к клетке реципиенту без наличия факторов переноса.

Различают следующие виды плазмид: Соl-фактор – колициногенный фактор, F-фактор – фактор фертильности, R-фактор – фактор устойчивости к лекарственным веществам, плазмиды биодеградации, плазмиды, кодирующие факторы вирулентности у микроорганизмов (Ent, Hly, Sal, K и т. д.)

Col-факторы – это плазмиды, контролирующие синтез бактериоцинов, обладающих способностью подавлять развитие филогенетических родственных бактерий. Название бактериоциногенов присваивают с учетом вида микроорганизмов их продуцирующих. В настоящее время известно, что практически почти все патогенные бактерии продуцируют бактериоцины.

Бактериоцины кишечной палочки называют колицины, стаффилококка – стаффилоцины, пневмококка – пневмоцины, вибриона – вибриоцины и т. д.. Лучше других бактериоцинов изучены колицины. Культуры кишечной палочки, продуцирующие колицины, называют колициногенами, а чувствительные к ним – колициночуствительными. Колицины – вещества белковой природы. Они обладают способностью ингибировать синтез ДНК, РНК, белка, вызывать гибель клетки не нарушая ее целостности. Колицины обладают летальным признаком, т. е. после их продукции бактериальная клетка может погибнуть. Колицины функционируют аналогично антибиотикам с узким спектром действия, обладают свойствами эндодезоксирибонуклеаз.

Бактериальные клетки, выделяющие бактерицины, устойчивы к действию гомологичных бактерицинов окружающей среды.

F-фактор может функционировать автономно и может быть в интегрированном, как эписома, состоянии. Этот фактор представляет собой кольцевую ДНК длиной 30-32 нм, молекула которой детерминирует перенос генетического материала из клетки донора в клетку реципиента, синтез половых ворсинок, синтез ферментов, способность к автономной репликации и т. д.

R-фактор генетическая структура, обеспечивающая устойчивость к лекарственным препаратам. Эта структура несет гены лекарственной устойчивости (ч-гены). Устойчивость к одному или нескольким лекарственным препаратам (антибиотикам) осуществляется за счет оперонов и может быть передана путем коньюгации и трансдукции.

Плазмиды биодеградации ответственны за использование органических соединений бактериями в качестве источников углерода и энергии, за утилизацию ряда сахаров, образование протеолитических ферментов.

Ent-плазмиды кодируют образование энтеротоксинов у энтеробактерий, Hly-плазмида – синтез гемолизинов у энтеропатогенных микроорганизмов и стрептококков. Sal-плазмида контролирует у псевдомонад использование бактериями салицилатов благодаря выработке предназначенного для этой цели фермента.

Последовательности и транспозоны

Кроме упомянутых выше генетических элементов (плазмиды, эписомы) у микроорганизмов наличествуют подвижные генетические элементы – последовательности и транспозоны, которые могут кодировать свою собственную транспозицию (перенос) от одного нуклеоида к другому или же между нуклеоидом и плазмидами. Такой перенос обусловлен способностью подвижных генетических элементов определять синтез ферментов транспозиции и рекомбинации – транспозаз.

Инсертиционные (вставочные) последовательности (is-элементы, от английского insertion – вставка, sequence – последовательность) обладают следующими свойствами. Они способны перемещаться по геному, реплицируя при этом is-элемент. В процессе репликации первичный экземпляр остается на месте, а копия встраивается в мишень, почти не обладающей специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции) закодированы в самом is-элементе. Транспозиция весьма редкое событие, которое происходит реже, чем спонтанные мутации. В местах смежных по отношению к инсерции возникают делеции и инверсии бактериальных геномов. Встроенная инсерция может либо активировать транскрипцию соседних генов, либо ингибировать их активность. Is-элементы обеспечивают взаимодействие между нуклеоидом, плазмидами и эписомами. В свободном состоянии is-последовательности не обнаружены.

Транспозоны состоят из 2500-20000 и более пар нуклеотидов и могут быть в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, которая обладает способностью перемещаться из хромосомы в плазмиды и наоборот, мигрируя с репликона на репликон. Некоторые умеренные фаги, например Ми-бактериофаг E. Coli, устроены аналогично и представляют собой гигантские транспозоны. Транспозоны могут быть носителями информации отвечающей за продуцирование токсинов и ферментов, ингибирующих антибиотики.