Болезнь Паркинсона: что изучать? как изучать?

Статья на конкурс «био/мол/текст»: Болезнь Паркинсона — второе по распространенности в мире нейродегенеративное заболевание. Протекание патологии ассоциировано с нарушениями аутофагии — способности клетки удалять поврежденные органеллы и белки. Статья расскажет читателю о связи аутофагии и митофагии с патогенезом паркинсонизма и о том, как применение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) помогает ученым исследовать клеточные аспекты заболевания.

Конкурс «био/мол/текст»-2017

Эта работа опубликована в номинации «Свободная тема» конкурса «био/мол/текст»-2017.

Генеральный спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий и партнером номинации «Биомедицина сегодня и завтра» выступила фирма «Инвитро».

Болезнь Паркинсона (БП) — это медленно прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции. Характерными симптомами являются тремор и брадикинезия (замедление активных движений, сопровождаемое мышечной ригидностью) (рис.1) [1].

Рисунок 1. Микрография — аномально малый почерк, характерный для пациентов с болезнью Паркинсона. На иллюстрации — пример почерка одной из пациенток психиатра 19 века Жана Мертена Шарко.

Клетки нашего организма содержат специальные компоненты — органеллы, которые необходимы для реализации множества процессов: например, шероховатый эндоплазматический ретикулум важен для синтеза белков, с помощью аппарата Гольджи белки могут сортироваться и транспортироваться к нужным клеточным регионам, а митохондрии являются энергетическими станциями наших клеток. Поскольку обнаружили, что митохондрии могут повреждаться при патогенезе паркинсонизма, рассмотрим подробнее эти органеллы.

Митохондрии вносят огромный вклад в энергетические ресурсы нашего организма за счет синтеза АТФ. Этому процессу предшествует восстановление кислорода до воды путем поэтапного переноса электронов между сложными молекулярными комплексами, встроенными во внутреннюю мембрану митохондрий. Можно сравнить электрон с футбольным мячом, который в результате 4 пасов должен попасть в ворота — кислород. При этом есть вероятность образования радикалов — активных форм кислорода с неспаренными электронами (например, это может произойти, если один из нормальных интермедиатов этого процесса — радикал убихинона — из-за медленного протекания процесса переноса электронов просуществует в мембране митохондрий достаточно долго для того, чтобы прореагировать с молекулярным кислородом) [2], [3].

На «Биомолекуле» есть интересная статья о том, почему активные формы кислорода могут оказаться важными для нашего организма: «Активный кислород: друг или враг, или о пользе и вреде антиоксидантов» [4].

Радикалы — это мутагенные вещества, оказывающие на клетку губительное влияние по причине их высокой реакционной способности. Для них характерны цепные реакции, в ходе которых радикал «отбирает» электрон у другой молекулы, тем самым делая радикалом «обворованную» молекулу. Не зря их накопление (а также повреждение митохондрий) выдвигается рядом ученых как одна из причин старения [3], [5]. Поэтому утилизация поврежденных митохондрий необходима для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки.

Закономерен вопрос: есть ли у клетки программа самозащиты от поврежденных органелл и неправильно собранных белков?

Внимание исследователей болезни Паркинсона направлено на множество молекулярных аспектов жизни клетки, один из которых — аутофагия (рис. 2). Можно сказать, что клетка — это «умный дом», следящий за собственной чистотой. Такая программа самоочищения — аутофагия — заключается в утилизации внутриклеточных органелл и макромолекул путем слияния аутофагосом (цитоплазматических включений, окруженных двойной мембраной, в которых расположены субстраты аутофагии) с лизосомами [6]. Выделяют несколько вариантов аутофагии — рисунок 2 [7].

Рисунок 2. Варианты аутофагии: макроаутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия. При микроаутофагии субстрат попадает в лизосому через ее мембрану. При макроаутофагии субстрат сначала окружается собственной двойной мембраной — образуется аутофагосома, которая в дальнейшем сольется с мембраной лизосомы и высвободит свое содержимое внутрь. При шаперон-опосредованной аутофагии субстрат (белок, в составе которого есть определенная последовательность аминокислот — так называемый KFERQ-мотив) будет доставлен в лизосому при помощи шаперона. Роль шаперона сводится к тому, что он «подведет» белок к поре в мембране лизосомы — LAMP-2A — и пропустит его внутрь.

Как изучать патологии на клеточном уровне?

Существует множество методов для изучения того, как протекает жизнь клетки. Каждый из подходов обладает своими недостатками и своими преимуществами, как следствие — своей применимостью к изучению той или иной проблемы. Ниже будет рассмотрен один из подходов, который активно используют для изучения патогенеза болезни Паркинсона в настоящее время.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) — стволовые клетки, полученные из дифференцированных клеток путем перепрограммирования. Перепрограммирование осуществляют введением в клетку определенного набора транскрипционных факторов (то есть белков, контролирующих транскрипцию — синтез РНК на матрице ДНК — с конкретных генов) и поддержанием клеток в специфической среде [8], [9].

ИПСК позволяют моделировать процессы, происходящие внутри клетки в норме и при патологиях (рис. 3). Безусловным преимуществом использования ИПСК является возможность более быстро и дешево получать необходимый тип клеток для исследований: например, благодаря легкости добывания фибробластов (клеток соединительной ткани) этот тип клеток часто используют для перепрограммирования. ИПСК позволяют избежать этических дилемм («правомерно ли использование клеток эмбриона для исследований?») и возлагать надежды на пациент-ориентированную терапию (например, после гибели клеток сердца перепрограммировать другой тип клеток пациента в кардиомиоциты и в дальнейшем пересадить их в орган) [7], [10]. Таким образом, с помощью ИПСК исследователи могут получать нейроны , которые можно использовать для изучения болезни Паркинсона.

Узнать подробнее о том, как сделать нейрон из фибробласта, можно в одноименной статье на «Биомолекуле» — «Как сделать нейрон из фибробласта?» [11].

Рисунок 3. Схема получения и использования ИПСК (iPSC) в биомедицине. В клетки (например, фибробласты), полученные как от больного, так и от здорового доноров, встраивают специальные конструкции, благодаря которым клетки начинают производить белки Oct4, Sox2, a-Myc, Klf4. Присутствие этих белков переводит клетку в плюрипотентное состояние. После этого над клетками совершают генетические манипуляции (например, вставляют мутацию или, наоборот, редактируют повреждения в каком-либо гене) и создают условия для того, чтобы клетка дифференцировалась — например, стала нейроном. На полученных нейронах могут изучать действие лекарственных препаратов и протекание заболевания.Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

В этой статье опишем несколько примеров того, как технология ИПСК и знания об аутофагии позволили исследователям приблизиться к пониманию процессов, происходящих при болезни Паркинсона.

Кто виноват? Что делать?

Прежде чем составлять сложные гипотезы о протекании патогенеза болезни и приступать к фармакологическим исследованиям, нужно найти «мишени», по которым следует бить. Мишени в данном случае — это какие-либо мутации и нарушения метаболизма клетки, ассоциированные с изучаемой болезнью. Ниже рассмотрим список потенциальных мишеней паркинсонизма, среди которых есть белки, связанные с функционированием митохондрий, — вовлеченность этих органелл в патогенез обсуждалась ранее.

LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) — мультидоменный фермент, 90% которого представлены в цитоплазме, а оставшиеся 10% — ассоциированы с внешней мембраной митохондрий. Мутации LRRK2 часто обнаруживают у пациентов с паркинсонизмом, при этом наиболее распространенные мутации расположены в доменах, отвечающих за киназную (фосфорилирующую) и ГТФазную (гидролизующую ГТФ) активности. Одна из наиболее часто встречаемых мутаций — G2019S — обсуждается ниже [7].

LC3-II (light chain 3 — II) — белок, расположенный на внутренней и внешней частях мембраны аутофагосом. После того, как мембрана аутофагосомы замыкается сама на себе, образуя внутриклеточный пузырек, чье содержимое подлежит уничтожению, LC3-II удаляется с внешней (то есть смотрящей в цитоплазму) мембраны. При этом «внутренний» LC3-II сохраняется и после слияния аутофагосомы с лизосомой деградирует (рис.4) [7].

Рисунок 4. После образовании аутофагосомы LC3-II удаляется с внешней стороны ее мембраны.

Рисунок 5. Схема фрагментации митохондрий.

В одном из исследований рассматривали ИПСК, полученные от доноров с паркинсонизмом (в одной линии присутствовала мутация G2019S, в другой — нет) и от здоровых доноров. После дифференцировки ИПСК в дофаминергические нейроны выяснилось, что уровень LC3-II повышен в образцах с БП. При этом электронная микроскопия показала, что в «здоровых» нейронах преобладают аутофаголизосомы (то есть аутофагосомы, мембрана которых слилась с лизосомой), в то время как в нейронах с фенотипом БП большинство аутофагосом не слилось с лизосомальной мембраной. Исследователи предполагают, что полученный результат позволяет сделать вывод о нарушении слияния аутофагосомы с лизосомой [12].

Drp1 — находящийся в цитоплазме белок, фосфорилируемый киназным доменом LRRK2. Фосфорилирование активирует Drp1, и протеин, подойдя к митохондриям, взаимодействует с адапторами на внешней мембране органеллы (например, Fis1). В результате митохондрия фрагментируется, высвобождая при этом активные формы кислорода и факторы клеточной смерти (апоптоза) (рис.5) [13], [14].

Фрагментация митохондрий — важный процесс: во-первых, путем деления получаются новые митохондрии; во-вторых, митохондрии способны сливаться, и фрагментирование поврежденной митохондрии предотвращает ее слияние с нормально функционирующей органеллой.

Известно, что при мутации G2019S активность киназной функции LRRK2 повышена и, как и ожидалось, концентрация Drp1 на внешней мембране митохондрий также увеличена. Группа ученых разработала селективный ингибитор Drp1 — P110, препятствующий избыточному делению митохондрий. P110 подавляет фосфорилирование Drp1, не давая ему перейти в активную форму. Возможный механизм этого ингибитора — конформационное изменение Drp1 и, как следствие, недоступность сайта фосфорилирования Drp1 для киназного домена LRRK2.

Для того чтобы проверить действие разработанного ингибитора, исследователи получили ИПСК LRRK2 G2019S из фибробластов пациентов, больных паркинсонизмом, и ИПСК с немутантной LRRK2 из фибробластов здоровых людей. В дальнейшем клеточные линии перепрограммировали в дофаминергические нейроны. В нейронах, несущих мутацию, митохондрии были меньше по размеру и присутствовали в бóльшем количестве, чем в нейронах с нормальным LRRK2, что указывало на повышенную фрагментацию. Последствия применения P110 выражались в увеличении размера митохондрий и сокращении расстояния между ними [15].

Важно акцентировать внимание на том, что на примере этой работы мы можем увидеть, каким образом ИПСК могут использоваться для тестирования потенциальных лекарственных препаратов.

С чего начинается митофагия? С заветного PINK1

Для того чтобы подробнее познакомиться с протеканием митофагии (уничтожения митохондрий путем аутофагии), мы рассмотрим этот процесс в хронологическом порядке. Повреждения митохондрий приводят к деполяризации мембраны этих органелл, и PINK1 — первый обсуждаемый нами белок — принимается за дело.

PINK1 — киназный белок, встроенный в мембрану митохондрий и выполняющий роль датчика повреждений этих органелл. Деполяризация митохондриальной мембраны сообщает PINK1 о нарушении работы митохондрий — в ответ на это PINK1 фосфорилирует расположенный неподалеку убиквитин, предварительно «навешанный» на белок внешней мембраны митохондрий (убиквитин — это белок, который, как правило, играет роль универсального «пропуска» на процедуру уничтожения каких-либо клеточных компонентов).

Фосфорилирование запускает каскадный процесс, именуемый «положительной обратной связью». С фосфорилированным убиквитином контактирует белок Parkin (назовем его «новобранец»), у которого в результате контакта изменяется взаимное расположение доменов. Это, во-первых, обеспечивает фосфорилирование «новобранца», и в ответ на это с ним контактирует «следующий новобранец», который в дальнейшем будет фосфорилирован. Во-вторых, фосфорилирование дает зеленый свет убиквитинлигазной функции белка Parkin — это означает, что на другие белки митохондриальной мембраны будет «пришит» убиквитин (рис. 6а). С убиквитированными белками (например, с VDAC1) контактируют рецепторы аутофагии p62, которые, в свою очередь, связываются с LC3-II — компонентом мембраны аутофагосомы, которая «запаковывает» в себя поврежденную митохондрию и в дальнейшем сливается с лизосомой (рис. 6б) [16], [17].

Рисунок 6а. Действие белка Parkin. Условные обозначения: Ub — убиквитин; pS65-Ub — убиквитин, у которого аминокислота серин в позиции 65 фосфорилирована; Phosphorylation — фосфорилирование.

Рисунок 6б. Убиквитирование VDAC1, проводимое белком Parkin, ведет к митофагии.