Плоды освещения Почему светящееся растение станет иконой «самодельной» биотехнологии будущего

На сайте Kickstarter недавно завершился сбор средств на создание первого «детища системной биологии» — светящегося растения Arabidopsis thaliana. Энтузиасты пожертвовали почти полмиллиона долларов трем молодым людям, которых пресса уже прозвала «биохакерами» — в том числе и потому, что их работа не подпадает под юрисдикцию FDA и других госорганов, которые обычно занимаются регуляцией ГМО в США.

«В труднодоступных высокогорьях Панамы, в бассейнах, охраняемых сторожевыми собаками, окруженная сетками и колючей проволокой, плавает самая дорогая и изученная рыба в мире». Так начинается текст Nature о лососе с эндогенной продукцией гормона роста, который уже 18 лет пытается вывести на рынок компания AquaBounty. В следующем году, пока быстрорастущий лосось, скорее всего, так и будет плавать в панамском бассейне, ожидая очередного одобрения от госорганов США, частные энтузиасты без всякой бюрократии получат семена первого «детища системной биологии» — светящегося растения Arabidopsis thaliana.

Быстрорастущий генетически модифированный лосось (вверху) компании AquaBounty растет в три раза быстрее обычного.

Никакого контроля за распространением «живой лампочки» не подразумевается: по уверениям авторов проекта, правительство США не имеет полномочий контролировать создание таких организмов, если они не предназначены для употребления в пищу (и это притом, что ДНК растения будет оснащена не одним, а целой батареей рекомбинантных генов). Вложившиеся в проект энтузиасты смогут свободно выращивать светящиеся растения, собирать их семена и даже (возможно) получать новые светящиеся гибриды.

Фермент Люцифера

В популярной прессе светящимися называют организмы, обладающие и флюоресценцией, и люминесценцией. Оба процесса встречаются в природе (порой у одних и тех же организмов) и оба используются в качестве исследовательских инструментов. Но если флюоресценция предполагает пассивное переизлучение света с небольшим уменьшением энергии и соответствующим сдвигом в длине волны, то люминесценция — это активный процесс, в ходе которого химическая энергия преобразуется в свет.

Ферменты, которые проводят преобразование химической энергии в свет, называются люциферазами, а их субстраты — люциферинами (оба слова происходят от латинского lucifer — «несущий свет»). Несмотря на одинаковое название, между люциферазами и люциферинами, скажем, жуков-светляков и бактерий, помимо собственно функции, очень мало общего: они имеют разное строение, разное происхождение и по-разному работают.

Наиболее известной является система свечения жуков-светляков. В ходе реакции, которую катализирует люцифераза, молекула АТФ, универсальная единица клеточной энергии, активирует люциферин, после чего к нему присоединяется кислород (интересно, что у всех организмов, несмотря на независимое возникновение системы свечения, оно так или иначе связано с окислением). «Магия» происходит в тот момент, когда от окисленного люциферина отделяется CO2: молекула красителя оказывается в возбужденном состоянии, покидая которое она испускает квант света.

Свет, производимый люциферазой, может иметь почти любой оттенок — от сине-зеленого до красного. Здесь, однако, есть интересная тонкость: у многих кишечнополостных (кораллов, медуз и их родственников) в клетках встречаются одновременно и люцифераза, и флюоресцирующие белки (например, небезызвестный GFP). Причем обычно они не просто находятся в одной клетке, но и настолько тесно связаны друг с другом, что возникает квантовый эффект переноса возбуждения: фотон, произведенный люциферазой, не излучаясь, переносится на GFP, который его выбрасывает уже с измененной длиной волны. Поэтому такие беспозвоночные, как Renilla reniformis, светятся не синеватым, а зеленым. Использование GFP позволяет увеличить эффективность излучения за счет того, что флюоресцентный белок по сравнению с люциферином таких организмов менее склонен терять возбужденное состояние без излучения кванта света. У жуков-светляков, равно как и у люминесцентных бактерий, нет белков, подобных GFP, и в этом отношении их система свечения устроена проще.

Японский светлячок Luciola cruciata, гены которого использовались в проекте iGEM

Потенциал биолюминесценции для исследований ученые распознали сразу же, как только стал известен ее механизм. После появления технологии рекомбинантных ДНК последовательность люциферазы стали «пришивать» к любым интересным генам и следить за тем, как их активация сопровождается свечением. Фармкомпании взяли на вооружение люциферазу взамен обычного красителя в лабораторных тест-системах: она, в отличие от красителей, позволяет полностью избавиться от постороннего «шума». Исследования биолюминесценции, в основном в связи с различными практическими методами ее использования, превратились в целую отрасль биотехнологии со своими журналами, обществами, конференциями и другими атрибутами.

Тем не менее с точки зрения биотехнологии эта система не лишена недостатков. Во-первых, после окисления и испускания кванта света отработанный люциферин уже непригоден для реакции и его требуется регенерировать. Помимо прочего, такой люциферин сам по себе ингибирует работу фермента. Для лабораторных тест-систем этот недостаток не имеет особого значения: в плашку можно просто добавить побольше субстрата. Но если речь идет о создании отдельных светящихся организмов, то регенерация люциферина становится настоящей проблемой.

Во-вторых, если люцифераза светлячков кодируется всего одним геном и его относительно просто внести в геном, то люциферин — это органическая молекула. Чтобы ее синтезировать, в геном нужно вставлять целую батарею генов, которые собирают люциферин из кусочков. Достигнуть этой цели ученым удалось только недавно.

Omphalotus olearius - один из множества естественно люминесцирующих грибов, которые не вызывают протестов экоактивистов.

Первые «условно светящиеся» растения, полученные (.pdf) группой Стивена Хоувелла в 1986 году (морковка и табак), содержали только саму люциферазу и сами по себе света не излучали — их надо было опрыскивать люциферином или добавлять его в почву. Это, кстати, можно заметить и на фотографиях, которые впоследствии стали символом проекта Glowing Plant — на них у табака сильнее всего светятся корни и сосуды, но не потому, что там лучше работает люцифераза, а потому, что по ним из почвы движется субстрат.

Первое растение, способное светиться само по себе, было получено гораздо позже — лишь в 2010 году. Над ним работали Александр Кричевский и его коллеги из университетов Нью-Йорка и Израиля. Для того чтобы заставить табак производить собственный люциферин, ученые использовали блок генов из люминесцирующих бактерий Photobacterium leiognathi. При этом гены встроили в геном хлоропластов — таким образом, чтобы они не могли распространяться с пыльцой.

Однако трансгенный табак светился очень слабо — его свет едва виден на фотографиях с очень длинной выдержкой. Это объясняется, как мы уже знаем, проблемой регенерации люциферина, а также тем, что гены не всегда эффективно работают при переносе из одного организма в другой. В целом для исследования растений такая генетическая система вполне подходила (Кричевский даже зарегистрировал соответствующий патент), но о других применениях никто, по-видимому, до последнего времени не задумывался.

Post Tenebras Lux

Ученые всегда рассматривали конструкции с люциферазой исключительно как маркеры, способные подсветить интересующие их клетки или помочь измерить активность исследуемых генов. Сама же мысль о том, что подобные рабочие инструменты можно использовать для чего-то совершенно с исследованиями не связанного, появилась у группы студентов, участвовавших в конкурсе iGEM, который вот уже несколько лет организует Массачусетский технологический институт. В рамках этого конкурса молодые ученые из разных стран собираются в команды, придумывают и реализуют небольшие проекты, которые так или иначе могут быть отнесены к области синтетической биологии.