СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ, патент № 2059413

В.Томеску, И.Гаврилэ, Д.Гаврилэ. Зоонозы, М.: Колос, 1982, с.115.

(71) Имя заявителя

Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерации

(72) Имя изобретателя

(73) Имя патентообладателя

Научно-исследовательский институт микробиологии Министерства обороны Российской Федерац

Реферат

Использование: медицина, специфическое лечение сапа, предотвращение развития у млекопитающих заболевания сапом. Сущность изобретения: белок, выполняющий порообразующую функцию в клеточных стенках Pseudomonas mallei, очищенный от цитоплазматических белков и пептидогликана, с молекулярной массой 37 - 40 кД, вводят подкожно чувствительным к сапу животным из расчета 100 - 30000 мкг белка на 1 кг массы животного. Через 12 - 24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение двух суток после заражения или до исчезновения клинических проявлений заболевания при развившейся сапной инфекции. Способ обеспечивает 100% выживание золотистых хомячков, зараженных подкожно 10 - 20 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei и 52% золотистых хомяков с развившейся сапной инфекцией при 100%-ной гибели нелеченных животных. 2 табл.

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

к патенту Российской Федерации

(46) 10.05.96 Бюл. № 13

(72) Супотницкий М.В., Кузнецов С.М., Полевщиков С.Н., Желнина Т.Б.

(54) СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ САПА У ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к медицине, в частности к способам специфического лечения, и может быть использовано для предотвращения развития у млекопитающих заболевания сапом.

Задачей изобретения является блокирование проникновения P. mallei в клетки млекопитающих.

Решение задачи достигается путем введения чувствительным к возбудителю сапа млекопитающим белков, выполняющих порообразующую функцию в клеточных стенках сапного микроба.

Изобретение основано на впервые обнаруженной авторами способности пориновых белков из P. mallei останавливать развитие сапной инфекции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

Пориновые белки, очищенные от цитоплазматических белков и пептидогликана, вводят подкожно чувствительным к сапу животным (в наших опытах — золотистые хомячки) из расчета 100–30000 мкг белка на кг массы животного. Через 12-24 ч введение белка повторяют. Лечение осуществляют как минимум в течение 2-х суток после заражения или до исчезновения клинических признаков заболевания (при развившейся сапной инфекции). Для определения протективного эффекта выполняют подкожное заражение животных вирулентной культурой P. mallei в количествах, достаточных для их гибели. В течение 30 сут ежедневно фиксируют число павших животных. При заражении культурой вирулентного штамма P. mallei выживаемость животных зависит от дозы и кратности введения препарата. Способ обеспечивал выживание до 100% золотистых хомяков, зараженных подкожно 10-20 смертельными дозами агаровой культуры высоковирулентного штамма P. mallei. Ц-5.

Существенным признаком заявляемого изобретения является использование в качестве лечебного средства белка, выполняющего порообразующую функцию в клеточных стенках возбудителя сапа. Между существенным признаком заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом существует причинно-следственная связь, а именно — избирательное связывание введенных млекопитающему поринов со специфическими рецепторами, узнаваемыми P. mallei на поверхности эукариотических клеток, приводит к нарушению адгезии бактерий к наружной части плазматической мембраны клеток эукариот. В результате происходит нарушение процесса проникновения бактерий во внутрь клеток млекопитающих, что вызывает их гибель и предотвращает развитие инфекционного процесса.

Препараты пориновых белков, выделенные из возбудителя сапа, не обладают токсическим действием в отношении золотистых хомяков в дозах 30 мг/кг массы животного. Обнаружение способности у пориновых белков, выделенных из клеток возбудителей сапа, предотвращать и излечивать заболевание, вызываемое P. mallei, позволяет их использовать для экстренной специфической профилактики и лечения данного заболевания и в частности вызываемого антибиотикоустойчивыми штаммами P. mallei.

Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Выделение поринового белка из культуры штамма P. mallei Ц-5

Для выделения поринового белка использовался способ, разработанный Новиковой О.Д. для псевдотуберкулезного микроба (Новикова О.Д. Порообразующий белок из внешней мембраны Yerslnla pseudotuberculosls. Химическая характеристика и биологическая активность: Дис. канд. биол. наук. - Владивосток, 1986). Способ заключается в следующем. К 6 г ацетон-высушенных клеток возбудителя сапа добавляют 600 мл охлажденного физиологического раствора и в течение 2 ч клетки суспендируют на магнитной мешалке при температуре 4±2°С. Затем их охлаждают центрифугированием в течение 45 мин при 600 g. Осадок суспендируют с 200 мл 0,03 М трис-HCI буфера (рН 7,2) (далее - буфер А), содержащего 2% тритона X-100, и экстрагируют при температуре 4±2°С в течение 2 ч при интенсивном перемешивании. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 15 мин, промывают буфером А, суспендируют в 200 мл буфера, добавляют 2 мл 1М раствора MgCI и 10 мг ДНК-азы (Реахим НПО «Биохимрсактив») и инкубируют 12 ч.

Осадок отделяют центрифугированием при 20000 g в течение 30 мин, промывают буфером А, суспендируют в 150 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия и экстрагируют при температуре 60±1°С в течение 15 мин. Комплекс пептидогликан-белок отделяют центрифугированием при 45000 g в течение 1 ч.

Осадок промывают водой, растворяют его в 100 мл буфера А, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 0,5 М NaCI, выдерживают при температуре 37±0,5°С в течение 30 мин. Затем осадок отделяют центрифугированием. Суспендируют его в 50 мл буфера А, содержащего 2% додецилсульфата натрия, и кипятят на водяной бане 10 мин.

Пептидогликан отделяют центрифугированием. Разделение белков ведут гельфильтрацией в сефакриле S-200 или другом носителе. Выделенный препарат представляет собой гидрофобный белок с молекулярной массой 37-40 килодальтон. В реакции диффузионной преципитации с диагностическими сыворотками к возбудителю сапа образует одну четкую линию.

За принадлежность выделенного белка к белкам класса поринов говорит следующее: метод выделения Новиковой О.Д. может быть использован только для выделения порообразующих белков, локализованых в наружной мембране и тесно связанных с липополисахаридами; белок проявляет выраженные гидрофобные свойства и нерастворим в воде; он обладает способностью индуцировать выраженный видоспецифический иммунитет; молекулярная масса мономера 37-40 кД, что у мембранных белков характерно только для поринов.

Пример 2. Определение протективного эффекта для золотистых хомяков

Выбор золотистых хомяков для опытов по оценке протективного эффекта порина из Р. mallei обусловлен их очень высокой чувствительностью к данному возбудителю.

Опыт 1. Доказательство способности порина P. mallei предотвращать заболевание сапом.

Условия выполнения опыта и его результаты приведены в табл. 1.

Таблица 1

Доказательство способности порина P. mallei предотвращать заболевание сапом

📎📎📎📎📎📎📎📎📎📎